RNA-simple isolation Reagent

適用范圍:常規動物組織(如：肝臟、心臟、腎臟、腦組織、骨骼肌等，不包括脾臟和肺臟)、植物組織(如水稻、玉米、擬南芥、煙草、小麥、大豆等，不包括棉花)、各類細胞系均具有很好的提取效果。保存條件：2-8℃提取試劑操作流程：

廣泛適用于從各類動物組織、植物材料、培養細胞、細菌等 樣品中提取 Total RNA 和Small RNA。與傳統 Trizol 一樣屬于通用型 Total RNA 提取試劑，與 傳統 Trizol 提取方法相比，本產品使用方法簡單，不需要使用氯仿進行分層，且全程可在常溫 進行；此外，本產品在高效地抑制 RNA 酶(Rnase)活性的同時，將蛋白質、DNA、多糖等雜 質沉淀到管底，從而實現單相提取，并有力保證了 RNA的完整度和純度。使用本產品在 50min 內即可完成全部的提取過程，提取的 RNA 可以直接用于 cDNA 克隆、qRT-PCR 檢測、mRNA 純化、體外翻譯、Northern blotting雜交、高通量測序等各種分子生物學實驗。

使用方法1.樣本處理1) 動物/植物組織① 將新鮮組織經液氮速凍后，迅速轉移至液氮預冷的研缽中，用研杵研磨，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀(無明顯可見顆粒)。▲研磨不全會影響 RNA 的得率和質量。② 將研磨成粉的樣品轉移至離心管中，大約每25mg組織加入500ul本試劑，劇烈振蕩或移液槍吹打，使樣品充分裂解。▲ 每500ul本試劑最多可以裂解50mg常規組織，過多的樣本量可能會導致裂解不充分，并使產物純度降低。▲部分韌性強或含較多外基質的組織，可能會出現不能全溶解的現象，在下一步操作RNA 提取的步驟 2)中將進入沉淀中，不會影響后續 RNA 提取及 RNA 質量。▲ 若沒有條件用液氮研磨，可將新鮮組織盡量剪碎浸泡在本試劑中，用電動勻漿器高速勻漿至組織塊全裂解。2) 懸浮細胞① 離心收集細胞，將獲得的細胞沉淀用1×PBS重懸，再次離心，棄盡上清。② 加入本試劑，每1 - 5×106個細胞加入500ul本試劑。③ 用移液器反復吹打直至充分裂解。3) 貼壁細胞① 棄去細胞培養液，用1×PBS清洗一次。② 通常，每10cm直徑的細胞培養皿培養的細胞加入2-3ml本試劑，常規六孔板(孔直徑3.5cm)每孔加500ul本試劑，使之充分覆蓋到細胞表面，然后用移液器將細胞吹打下來。▲對于貼壁牢固的細胞(細胞團)可采用細胞刮或潔凈的槍頭剝離，亦可在加入本試劑之前采用胰酶將細胞消化下來，然后按照懸浮細胞處理。③ 將裂解液轉移至離心管中，用移液器反復吹打直至充分裂解。2.RNA提取1) 向上述裂解液中加入2/5體積的Rnase-free Water(每500ul本試劑使用200ul)，上下顛倒混勻，室溫靜置5min。2) 12,000×g 室溫離心15min。3) 取出離心管，此時溶液分成上層水相(含RNA)和深色的下層沉淀(含蛋白質、DNA、多糖等雜質)，小心吸取上層水相至一個新的離心管中。▲上層水相的體積約占總體積的 90%，如用 500ul 本試劑進行提取，上層水相約為 640ul，建議吸取 500ul；針對微量的樣本進行提取時，為減少 RNA 損失，可以全部轉移上清。▲當樣本的投入低于推薦量時，離心后可能不會出現下層沉淀，屬于正常現象，可繼續按后續步驟完成提取。4) 加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10min。5) 12,000×g 室溫離心10min，通常可以看見白色沉淀，小心棄去上清。▲部分組織材料由于含有較多的代謝產物，導致沉淀不能聚集而分散在離心管壁上，此時，請沿液面緩慢吸取上清。6) 加入500ul 75%乙醇(Rnase-free Water配制)，輕彈管底讓沉淀懸浮起來，并上下顛倒數次。7) 8,000×g 室溫離心3min，棄去上清。8) 重復步驟6和7一遍，棄盡上清。▲為減少雜質殘留，應盡可能的將上清棄干凈。建議棄去大部分上清后，短暫離心將殘留液體甩至管底，再用移液器將剩余液體全部吸掉。9) 室溫放置晾干，加入適量的Rnase-free Water溶解沉淀，室溫渦旋3min(或使用移液器反復吹打)，使RNA沉淀充分溶解。提取的RNA產物可以分裝后在-85~-65℃長期保存，在-30~ -15℃僅可短期保存。▲RNA 沉淀晾干 2-3min 即可，不要過度晾干，RNA 全干燥后會很難溶解。▲RNA 產物需要充分溶解，否則可能導致濃度定量失準以及 OD260/OD280 比值偏低。3.產物檢測1) 產物純度可用分光光度計檢測，OD260/OD280比值在1.8-2.2之間表明RNA純度較高。2) 產物濃度可以采用分光光度計檢測，RNA濃度(ng/ul)=OD260×稀釋倍數×40；或者采用Qubit直接檢測。3) 取0.5- 1ug RNA，用1×TE或Rnase-free Water稀釋至8ul，再加入1ul 10×DNA loading buffer，混勻，進行1%瓊脂糖凝膠電泳；或采用2100檢測，測定RNA產物的RIN值。 

常見問題及解決方案 

1.RNA發生降解RNA降解可能發生在多個環節，實驗過程中需要注意以下事項：① 確保提取RNA的試劑和器具沒有被Rnase污染，所有離心管、槍頭及相關溶液都必須無Rnase污染，耐高溫器物可于150℃烘烤4-6h以去除Rnase，其它器物可用0.1%DEPC水浸泡過夜；② 做好防護工作，戴口罩和一次性干凈手套，并在單獨的潔凈區操作；③ 細胞或組織樣品需立即加入本試劑，并迅速進行勻漿裂解。若處理不當，發生細胞或組織凍融，Rnase會被釋放出來降解RNA。針對內源Rnase含量高或不易勻漿的組織，需將組織切成小塊后立即投入液氮冷凍，然后進行研磨，在整個研磨過程中，樣品不得融化；④ 提取的RNA樣品需要妥善保存，建議取少量進行檢測，其余樣品分裝于-85~-65℃保存。進行電泳檢測可以提高電壓并縮短跑膠時間，同時對電泳緩沖液進行冰浴降溫，防止跑膠過程中RNA發生降解。2.出現污染① 蛋白質污染：采用分光光度計檢測提取產物OD260/OD280偏低時，提示可能存在蛋白質污染。遇到此種情況，需要考是否組織投入量過大，導致裂解不充分，可以適當增加本試劑或者降低組織投入量進行提取；② 多糖污染：采用分光光度計檢測提取產物OD260/OD230偏低時，提示可能存在多糖污染，需要考慮是否是因為乙醇未去除干凈或者是組織投入量過大導致，此時，可以在RNA提取步驟9時適當延長RNA晾干時間或適當降低組織投入量進行提取操作；③ 脂肪污染：處理脂肪含量豐富的組織時，經過RNA提取步驟2之后，上層是大量脂肪，可以轉移澄清的中間層進行下一步操作。3.加入異丙醇離心后看不見沉淀通常情況下，經過異丙醇沉淀可以看見白色沉淀。若遇到沉淀不可見的情況，可能是RNA含量低或者組織投入量過低，建議加入異丙醇(RNA提取步驟4)后在2~8℃或-30~-15℃放置10-30min后再離心；且在RNA提取步驟5進行棄上清操作時，請采用吸取而不是傾倒的方法，以免沉淀丟失。此外，部分組織材料由于含有較多的代謝產物，導致沉淀不能聚集而分散在離心管壁上，此時，請沿液面緩慢吸取上清。4.如何保存組織樣本如果不能立刻提取 RNA，應將組織離體后迅速投入液氮冷凍，并用液氮保存；或液氮速凍后，轉移至-85~-65℃保存。不能直接將新鮮組織放在-85~-65℃冷凍，因為樣品的凍結是一個緩慢的過程，在這個過程中內源 Rnase 會將 RNA 降解。

本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途

上海牧榮生物科技有限公司

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