海藻糖含量測試盒

微量法100管/96樣

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

海藻糖廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中。由于海藻糖具有不同于其他碳水化合物的生物學特性，能在干旱、高溫、脫水、冷凍、高滲透壓及毒性物質等惡劣環(huán)境下保護生物體細胞蛋白質、脂肪、糖類、核酸等組分不受損害。

測定原理：

蒽酮比色法。具有靈敏度高﹑簡便快捷﹑適用于微量樣品的測定等優(yōu)點。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板﹑研缽、濃硫酸（不允許快遞）和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 100ml×1瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存；

海藻糖提取：

1、細菌或細胞處理：收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重復30次），室溫靜置45min，振蕩3~5次，冷卻后，8000g，25℃離心10min，取上清。

2、組織的處理：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），冰浴勻漿，室溫靜置45min，振蕩3~5次，冷卻后，8000g，25℃離心10min，取上清。

3、血清（漿）的處理：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）加入1mL提取液），冰浴勻漿，室溫靜置45min，振蕩3~5次，冷卻后，8000g，25℃離心10min，取上清。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至620nm，蒸餾水調零。

2. 調節(jié)水浴鍋至95度。

3、工作液的配制：臨用前在試劑一中加入3.75mL蒸餾水后，緩慢加入21.25mL濃硫酸，不斷攪拌，充分溶解，待用；用不完的試劑4℃保存一周；

4、樣本測定：取60μL樣本和240μL工作液至EP管中，95度水浴10 min（蓋緊，防止水分散失），自然冷卻至室溫，取200uL至微量石英比色皿或96孔板中，在620 nm 波長下記錄測定吸光度值A。

注意：由于工作液具有強腐蝕性，請謹慎操作。

若吸光值大于1，請將樣本用提取液稀釋后再測定，計算公式中乘以相應的稀釋倍數(shù)。

海藻糖含量計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸方程為y = 8.8976x+0.0729；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、按樣本鮮重計算：

海藻糖含量(mg/g 鮮重)= [V1×(A -0.0729)÷8.8976]÷(W×V1÷V2)=0.112×(A -0.0729) ÷W。

3、按樣本蛋白濃度計算：

海藻糖含量(mg/mg prot)= [V1×(A -0.0729) ÷8.8976]÷(V1×Cpr)=0.112×(A -0.0729) ÷Cpr。

4、按細菌或細胞密度計算：

海藻糖含量(μg/104 cell)=[1000×V1×(A -0.0729) ÷8.8976]÷(500×V1÷V2)=0.224×(A -0.0729)

5、血清（漿）海藻糖含量計算

海藻糖含量（mg/mL）＝[V1×(A -0.0729）÷8.8976 )÷(V3×V1÷V2)=1.12×(A -0.0729)

1000：1mg/mL=1000µg/mL；V1：加入反應體系中樣本體積，60μL=0.06mL；V2：加入提取液總體積1mL；；V3：加入血清（漿體積），0.1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸方程為y = 4.4488x+0.0729；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、按樣本鮮重計算：

海藻糖含量(mg/g 鮮重)=[ V1×(A -0.0729)÷4.4488]÷(W×V1÷V2)=0.224×(A -0.0729) ÷W。

3、按樣本蛋白濃度計算：

海藻糖含量(mg/mg prot)= [V1×(A -0.0729)÷4.4488]÷(V1×Cpr)=0.224×(A -0.0729) ÷Cpr。

4、按細菌或細胞密度計算：

海藻糖含量(μg/104cell)=[1000×V1×(A-0.0729)÷4.4488]÷(500×V1÷V2)=0.448×(A -0.0729)

5、血清（漿）海藻糖含量計算

海藻糖含量(mg/mL)=[V1×(A -0.0729）÷4.4488 )÷(V3×V1÷V2)=2.24×(A -0.0729)

1000：1mg/mL=1000µg/mL；V1：加入反應體系中樣本體積，60μL=0.06mL；V2：加入提取液總體積1mL；；V3：加入血清（漿體積），0.1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

注意：*低檢測限為10μg/g鮮重或0.1μg/ mg prot

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