NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）酯和其他活化酯（磺基-NHS、磺基四氟苯基 - STP）是適合氨基修飾的反應(yīng)性化合物。 NHS 是最常見的活化酯類型。

常見的修飾是熒光標(biāo)記、熒光猝滅劑和其他報告基團。可以使用活化酯連接炔烴和疊氮基，以使生物分子適應(yīng)點擊化學(xué)。

尤其常見的是蛋白質(zhì)和肽的修飾，因為它們幾乎總是含有氨基。其他例子是氨基寡核苷酸的修飾、氨基修飾的DNA和含氨基的糖。

NHS 酯與氨基的反應(yīng)強烈依賴于 pH 值：在低 pH 值下，氨基被質(zhì)子化，并且不會發(fā)生修飾。在高于最佳 pH 值時，NHS 酯的水解速度很快，并且修飾分子的產(chǎn)率會降低。改性的最佳pH值為8.3-8.5。

水是用于溶解 NHS 酯以進行生物分子標(biāo)記的常用溶劑。如果NHS酯難溶于水溶液，可首先將其溶解在 二甲基亞砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)中，然后添加到pH 8.3-8.5緩沖液中的蛋白質(zhì)溶液中。請注意，DMF 可以降解為二甲胺，二甲胺具有魚腥味，并且能夠與活化酯發(fā)生反應(yīng)。因此，標(biāo)記生物分子時，使用不含二甲胺、無魚腥味的高質(zhì)量DMF非常重要。

我們建議使用以下通用方案用Lumprobe 生產(chǎn)的NHS 酯標(biāo)記生物分子：

1. 使用下面的公式或我們的蛋白質(zhì)標(biāo)記計算器計算所需的 NHS 酯量：

   NHS_酯_重量 [mg] = 8 × 氨基_化合物_重量 [mg] × NHS_酯_摩爾_重量 [Da] / 氨基_化合物_摩爾_重量 [Da]。

   8是摩爾過量的NHS酯。它是單標(biāo)記的經(jīng)驗值，適用于許多常見的蛋白質(zhì)和肽。然而，在某些情況下，使用更少或更多的 NHS 酯可以增加修飾生物分子的產(chǎn)量。它取決于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、標(biāo)記所用試劑及其溶解度。 Lumiprobe 產(chǎn)品的摩爾重量可以在相應(yīng)的產(chǎn)品頁面上找到。

   例如，要使用 Cy5 NHS 酯（摩爾量 616 道爾頓）標(biāo)記 3 mg BSA（摩爾量 66500 道爾頓），并獲得單標(biāo)記產(chǎn)物的最大產(chǎn)量，應(yīng)使用 8 × 3 mg × 616 Da / 66500 Da = 0.22 毫克 Cy5 染料 NHS 酯。

2. 計算反應(yīng)混合物的體積。標(biāo)記反應(yīng)中的最佳生物分子濃度為1-10 mg/mL。標(biāo)記可以在任何規(guī)模上進行，從納摩爾到幾十克。如果標(biāo)記少量生物分子，請將反應(yīng)混合物的體積保持在低水平 (10-20 uL)。

3. 將 NHS 酯溶解在 1/10 反應(yīng)體積的水、DMF 或 DMSO 中。不含二甲胺的DMF或水是優(yōu)選的溶劑。溶解在 DMF 中的 NHS 酯可在 -20°C 下在溶液中保存 1-2 個月。 NHS酯的水溶液配制后應(yīng)立即使用。

4. 將生物分子溶解在 9/10 反應(yīng)體積的 pH 8.3-8.5 緩沖液中。

   0.1 M 碳酸氫鈉溶液具有適當(dāng)?shù)?pH 值。另一種選擇是 0.1 M 磷酸鹽緩沖液。請注意，pH 值是成功用 NHS 酯標(biāo)記生物分子的最重要因素。避免使用含有胺的緩沖液（有時可以使用基于 Tris 的緩沖液，但不推薦使用。Tris 含有氨基，但對活化酯的親和力較低）。

   在進行大規(guī)模標(biāo)記（使用數(shù)百毫克 NHS 酯）時，請注意，由于 NHS 酯的水解，混合物會隨著時間的推移而酸化。監(jiān)測 pH 值，或使用濃度更高的緩沖液。

5. 將 NHS 酯溶液添加到生物分子溶液中，并充分渦旋。在冰上放置過夜，或在室溫下放置 1 至 4 小時。

6. 使用適當(dāng)?shù)姆椒兓Y合物：大分子凝膠過濾是最常見的。色譜法是另一種選擇。對于蛋白質(zhì)和核酸，可以使用乙醇或丙酮沉淀。有機雜質(zhì)（如 N-羥基琥珀酰亞胺、NHS 酯和水解產(chǎn)生的酸）幾乎總是可以通過這些方法輕松分離。