哺乳動物細(xì)胞裂解物中 GFP 融合蛋白的免疫沉淀 (IP/CoIP) 方案
該方案旨在對 GFP 標(biāo)記的融合蛋白進(jìn)行免疫沉淀，以通過蛋白質(zhì)免疫印跡或活性測定進(jìn)行分析。
溶液和試劑
1X 細(xì)胞裂解緩沖液：50 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100。建議在使用前添加 1 mM PMSF。
1X 洗滌緩沖液：TBS（50 mM Tris HCl，150 mM NaCl，pH 7.5）
5X SDS 上樣緩沖液
1. 準(zhǔn)備細(xì)胞裂解物
1. 要在非變性條件下收獲細(xì)胞，去除培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 沖洗細(xì)胞一次。去除 PBS 并向每個板（10 cm，106-107 個細(xì)胞）中加入 0.5 mL-1mL 1X 冰冷細(xì)胞裂解緩沖液（添加蛋白酶抑制劑混合物和 PMSF），并將板在冰上孵育 30-40 分鐘，4 °旋轉(zhuǎn)攝氏度。
2. 從平板上刮下裂解的細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到微量離心管中。繼續(xù)冰上。
3. 在冰上對樣品進(jìn)行超聲處理 3 次，每次 5 秒（可選步驟）。
4. 4°C、14,000 xg 微量離心 10 分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。如有必要，可將裂解物儲存在 –80°C 下。
注意：如果目的蛋白是核蛋白，請使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，并加入PIC、1mM PMSF、2.5mM Mgcl2和1mg/ml DNase I。
2. 平衡珠子
1. 顛倒產(chǎn)品管或輕輕上下吹打以重懸珠子。不要渦旋珠子。
2. 吸取 25 µL 珠漿到 EP 管（1.5 mL）中，然后加入 1 mL 冰冷的洗滌緩沖液。用手輕輕搖晃 1-2 分鐘。不要渦旋珠子。
3、磁選60秒。
4. 棄去上清，重復(fù)洗滌 3 次。
3. 免疫沉淀
1. 取 500 μL 細(xì)胞裂解液，加入 25 μL 抗體偶聯(lián)磁珠懸液，4°C 孵育 1-3 小時或 4°C 過夜。
4. 清洗蛋白質(zhì)-納米抗體-珠復(fù)合體
注意：如果研究了 Co-IP 相互作用的蛋白質(zhì)，請減少洗滌次數(shù)，并降低洗滌緩沖液的離子強度。
加入 1.0 mL 的 Wash Buffer 并懸浮珠子復(fù)合物，磁選，然后棄去上清液。重復(fù)上述步驟至少四次。
5. 下游分析的洗脫
GFP 融合蛋白的洗脫-根據(jù)蛋白質(zhì)特性或進(jìn)一步用途推薦兩種洗脫方法：
選項 A：天然洗脫
在酸性條件下用 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5) 洗脫。這是一種快速有效的洗脫方法。用中和緩沖液（1 M Tris，pH 10.4）中和洗脫的蛋白質(zhì)可能有助于保持其活性。中和緩沖液需要預(yù)先放入收集管中。
注意：需提前做初步實驗，確定中和甘氨酸（PH 2.5）需要多少中和緩沖液
選項 B：SDS-PAGE 的變性洗脫
在凝膠電泳和免疫印跡的變性條件下用樣品上樣緩沖液洗脫。
A：用 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5) 洗脫 - 該過程應(yīng)在室溫下進(jìn)行。
注意：不要將珠子留在該緩沖液中超過 20 分鐘。
1. 向每個樣品和對照珠復(fù)合物中加入 50 µL 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5)。
2. 在 4°C 下輕輕搖動或在旋轉(zhuǎn)器上孵育樣品和對照 5-10 分鐘。
3. 將試管放入磁力分離器中以收集珠子。將上清液轉(zhuǎn)移到含有 25-35 μL 中和緩沖液的新管中。小心不要轉(zhuǎn)移任何珠子。
4. 重復(fù)步驟 1-3 以提高洗脫效率，將洗脫液集中在同一管中或通過不同管收集洗脫液。
6. 如需立即使用，請將洗脫液儲存在 2-8 °C。儲存在 –20 °C 以進(jìn)行長期儲存。
B：用 SDS-PAGE 上樣緩沖液洗脫
1. 用 30 µL 1X SDS 樣品上樣緩沖液重懸每個樣品（6 µL 5X SDS 樣品上樣緩沖液可以添加到 24 µL 細(xì)胞裂解緩沖液中）。渦流。
2. 在 95 – 100°C 下將樣品管和對照管煮沸 10 分鐘。
3. 將試管放入磁力分離器中以收集珠子。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。樣品和對照已準(zhǔn)備好加載到 SDS-PAGE 上，并使用抗 GFP 或針對融合蛋白的特異性抗體進(jìn)行免疫印跡。
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